還在用傳統(tǒng)的切片染色來統(tǒng)計(jì)c-Fos嗎？OUT！
2024-12-12
即刻早期基因（Immediate early genes，IEGs）是一類特殊的基因，它們?cè)诩?xì)胞受到外部刺激后，會(huì)短暫而迅速地被激活。這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上做出響應(yīng)，代表了一種長(zhǎng)期的反應(yīng)機(jī)制，且其激活不需要蛋白質(zhì)的從頭合成。IEGs在細(xì)胞生化改變與細(xì)胞最終對(duì)刺激發(fā)生特異性反應(yīng)之間起著中介作用，它們不僅參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化過程，也參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞過程和細(xì)胞的能量代謝過程。
c-Fos是即刻早期基因（IEGs）的一種，屬于原癌基因，具有高度的保守性。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激或激活時(shí)，c-Fos基因會(huì)被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，編碼的核蛋白Fos可以在神經(jīng)元中富集表達(dá)。因此，c-Fos可以作為神經(jīng)元激活的標(biāo)記物，通過檢測(cè)其表達(dá)水平，可以了解神經(jīng)元的激活狀態(tài)，進(jìn)而研究神經(jīng)元的興奮性、突觸傳遞以及神經(jīng)精神性疾病的發(fā)生和發(fā)展。
優(yōu)點(diǎn)：
1. 操作簡(jiǎn)單易上手
2. 數(shù)據(jù)處理對(duì)軟硬件要求低
缺點(diǎn)：
1. 全腦統(tǒng)計(jì)工作量巨大，抗體消耗量大
2. 人工手動(dòng)切片無法保證全腦數(shù)據(jù)完整性
3. 需人工對(duì)每張腦片進(jìn)行腦圖譜配準(zhǔn)，誤差較大
4. 通常為15-50 μm厚切片，無法保證數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性
5. 無法精準(zhǔn)配對(duì)細(xì)胞的空間位置
fMOST>>>c-Fos
全腦三維成像
fMOST全腦c-Fos成像流程圖
案例1：
2024年8月，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院于生元/劉若卓團(tuán)隊(duì)在The Journal of Headache and Pain期刊發(fā)表了題為“Brain-wide mapping of c-Fos expression in nitroglycerin-induced models of migraine”的文章，該研究利用fMOST全腦成像揭示了慢性偏頭痛模型（CMM）中多個(gè)腦區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。
標(biāo)記方法：小鼠在造模前一個(gè)月尾靜脈注射rAAV-PHP.eB-c-Fos-EGFP病毒，該病毒可透過血腦屏障在腦組織中使cFos表達(dá)EGFP熒光蛋白，通過多次施加硝酸甘油誘發(fā)小鼠慢性偏頭痛，進(jìn)行最后一次偏頭痛造模后2h進(jìn)行取材，隨后進(jìn)行fMOST全腦成像并統(tǒng)計(jì)量化。
參考文獻(xiàn):https://doi.org/10.1186/s10194-024-01837-9
案例2：
2022年9月，空軍軍醫(yī)大學(xué)武勝昔與西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院趙艷團(tuán)隊(duì)在期刊Neurobiology of Stress發(fā)表題為“Brain-wide mapping of c-Fos expression with fluorescence micro-optical sectioning tomography in a chronic sleep deprivation mouse model”的研究論文。在本研究中，作者通過fMOST對(duì)睡眠剝奪模型小鼠進(jìn)行全腦c-Fos陽性細(xì)胞定位。
參考文獻(xiàn):https://doi.org/10.1016/j.ynstr.2022.100478
標(biāo)記方法：小鼠在造模前一個(gè)月尾靜脈注射rAAV-PHP.eB-c-Fos-EGFP病毒，在14天的睡眠剝奪之后，14天后進(jìn)行取材，隨后進(jìn)行fMOST全腦成像并統(tǒng)計(jì)量化。
優(yōu)點(diǎn)：
1. 避免了整腦c-Fos染色的染色不均一
2. EGFP蛋白具有良好的穩(wěn)定性，適用于各種樣本處理方式
3. 該方案較適用于長(zhǎng)期/慢性病理模型或多次施加刺激后研究特定腦區(qū)激活情況
缺點(diǎn)：
1. 需在刺激之前注射病毒，病毒表達(dá)周期會(huì)影響c-Fos表達(dá)量
2. 尾靜脈注射需要一定熟練度，病毒實(shí)際注射量會(huì)影響表達(dá)量
標(biāo)記方法：施加刺激后2h，小鼠進(jìn)行正常取材，鼠腦進(jìn)行整體免疫熒光染色、樹脂包埋和fMOST三維成像。該方案同樣適用于其他病理模型的特定腦區(qū)激活情況。
優(yōu)點(diǎn)：
1. 操作相對(duì)簡(jiǎn)單易上手
2. 無需病毒注射或者藥物誘導(dǎo)c-Fos的表達(dá)，常規(guī)正常造模即可
3. 較適合單次刺激或急性模型研究全腦c-Fos表達(dá)
缺點(diǎn)：
1. 需選擇能夠進(jìn)行整體染色的c-Fos抗體，且抗體消耗量大
2. 染色時(shí)間長(zhǎng)，且可能存在染色不均一，批次間差異較大
標(biāo)記方法：將cFos-TRAP小鼠與Ai14小鼠（Ai系列均可）雜交產(chǎn)下Fos-CreERT2小鼠，在cFos關(guān)聯(lián)事件前1h腹腔注射4-OHT（4-羥基他莫昔芬），事件結(jié)束后至少保證小鼠72小時(shí)不受干擾，隨后擇期進(jìn)行取材、樹脂包埋及fMOST三維成像。該方案同樣適用于其他病理模型的特定腦區(qū)激活情況。
優(yōu)點(diǎn)：
1. 腹腔注射可精準(zhǔn)把控誘導(dǎo)時(shí)間，減少非刺激相關(guān)因素的影響
2. 操作簡(jiǎn)單，只需要腹腔注射即可
3. 該方案慢性/急性或單次/多次均適用
缺點(diǎn)：
1. 轉(zhuǎn)基因老鼠昂貴
2. 因給藥環(huán)節(jié)變量較多，需同時(shí)使用陽性對(duì)照小鼠，同期檢測(cè)
參考文獻(xiàn)
1.Xiao, Shaobo et al. “Brain-wide mapping of c-Fos expression in nitroglycerin-induced models of migraine.” The journal of headache and pain，21 Aug. 2024
2.Cai, Guohong et al. “Brain-wide mapping of c-Fos expression with fluorescence micro-optical sectioning tomography in a chronic sleep deprivation mouse model.” Neurobiology of stress，7 Aug. 2022
2024
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所屬分類：
學(xué)術(shù)進(jìn)展
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