腎積水是臨床常見病，長期腎積水可能導(dǎo)致腎功能衰竭。不同的病因和嚴(yán)重程度的腎積水導(dǎo)致腎臟解剖結(jié)構(gòu)改變并影響治療方案的選擇。原位觀察腎積水分布和腎臟的解剖結(jié)構(gòu)有助于選擇治療方法。超聲、磁共振和CT在內(nèi)的在體成像可直接觀察腎臟的實時狀態(tài)，但分辨率低；組織切片、結(jié)合透明化的光片成像等的離體成像，因腎臟切除和固定改變了腎積水和血液灌注狀態(tài)。目前臨床上缺乏獲得腎積水的準(zhǔn)確 3D 分布和腎臟介觀解剖細(xì)節(jié)的技術(shù)。

2023年9月4日，MOST團隊在Theranostics上發(fā)表題為“3D autofluorescence imaging of hydronephro-sis and renal anatomical structure using cryo-micro-optical sectioning tomography”的研究，研究采用在體冷凍固定（IVCF）方法來維持小鼠腎臟的體內(nèi)形態(tài)和血管灌注狀態(tài)，分別選擇單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）和db/db小鼠作為急性和慢性腎積水模型，進行微米分辨率的全腎冷凍MOST自發(fā)熒光成像，獲得了小鼠腎積水分布，腎亞區(qū)、腎單元和腎血管的介觀解剖結(jié)構(gòu)變化，為理解腎積水的疾病發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

研究人員首先在無標(biāo)記下對正常小鼠腎臟的自發(fā)熒光進行cryo-MOST成像，重建了腎臟3D結(jié)構(gòu)，并對皮質(zhì)、外髓質(zhì)外條紋 (OSOM) 、外髓質(zhì)內(nèi)條紋 (ISOM)和內(nèi)髓質(zhì) (IM)四個腎亞區(qū)分割（圖1A-C）。與相比傳統(tǒng)PAS染色相比結(jié)構(gòu)清晰，血管、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)更加顯著易于區(qū)分。同時，對選取腎臟中的4 × 1 × 1 mm3 進行3D渲染和結(jié)構(gòu)重建（圖1M），發(fā)現(xiàn)靜脈和動脈成對存在，腎小管（綠色） 盤繞并延伸至髓質(zhì)區(qū)域（圖1M 黃色虛線框）。這些結(jié)果表明，cryo-MOST可以實現(xiàn)全腎的3D可視化，并能夠以單細(xì)胞分辨率對多種解剖結(jié)構(gòu)進行分析。

 圖1 正常C57小鼠腎臟cryo-MOST成像及其與PAS染色組織學(xué)切片比較

傳統(tǒng)冷凍固定主要是離體冷凍固定(EVCF)，指腎臟取出后冷凍固定，可能出現(xiàn)液體流出，影響灌注狀態(tài)和整體形狀；小鼠存活時進行在體冷凍固定（IVCF）可維持腎臟原始狀態(tài)。因此，研究人員以Micro-CT為對照，評估IVCF和EVCF對cryo-MOST 成像小鼠腎臟形態(tài)的影響（圖2A）。結(jié)果顯示IVCF 的cryo-MOST與 Micro-CT腎臟形態(tài)相似，體積、長寬厚度不變，而EVCF組腎臟部分變形（圖2D）；血管方面，EVCF組腎血管密度減少（圖2B、C、F），表明 IVCF 更好地保留了腎臟血管的解剖形態(tài)。

圖2 通過IVCF和EVCF進行cryo-MOST成像來評估活體小鼠腎臟形態(tài)保存

為評估cryo-MOST成像腎積水的可行性，首先測量了小鼠尿液的激發(fā)和發(fā)射矩陣熒光光譜，發(fā)現(xiàn)cryo-MOST可對530nm處的自發(fā)熒光進行成像（圖3A）。然后，對模型組小鼠進行單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）3天后成像，發(fā)現(xiàn)UUO腎臟體積增大，腎積水已擴展到ISOM并導(dǎo)致腎實質(zhì)嚴(yán)重變形（圖3B、M）。進一步分析顯示UUO引起腎臟長度、腎盂前后徑（APDRP）增加，腎實質(zhì)(RP)厚度降低；ISOM和IM腎亞區(qū)顯著變短（圖3C）。對體積測量顯示UUO組全腎體積、皮質(zhì)和ISOM亞區(qū)體積增大，IM亞區(qū)萎縮（圖3D）。有趣的是，盡管腎實質(zhì)和ISOM的厚度減少，但體積卻增加了，表明在UUO早期，這些區(qū)域是發(fā)生擴張而非萎縮。因此，2D 剖面圖像中的傳統(tǒng)長度測量無法準(zhǔn)確反映 3D 體積變化。進一步對比腎單位形態(tài)（圖3E-L），發(fā)現(xiàn)近曲小管（PCT，圖3I黃色箭頭）和亨利袢（圖3K 白色箭頭）在UUO中集中凸出，腎小管擴張，表明PCT和亨利袢更易出現(xiàn)腎積水。

圖3 對照小鼠腎臟和單側(cè)輸尿管梗阻 (UUO) 小鼠腎臟的cryo-MOST 成像

而后對血管進行了3D重建和量化，形態(tài)學(xué)顯示UUO腎臟靠近腎門的節(jié)段性血管萎縮（圖4A），橫截面減小且被拉長（圖4B、D）。同時，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和IM腎亞區(qū)的功能性毛細(xì)血管密度顯著降低（圖4F），表明皮質(zhì)和IM的微循環(huán)受損引起缺氧。因此，皮質(zhì)和IM比OSOM更易出現(xiàn)腎積水，可能與功能毛細(xì)血管的稀疏相關(guān)。因此，cryo-MOST 成像可以為早期腎臟病變的診斷提供獨特見解，并探索缺血和缺氧在腎臟疾病發(fā)展中的作用。

圖4 對照小鼠腎臟UUO小鼠腎臟的腎血管的3D重建和量化

進一步利用15W的慢性自發(fā)腎積水db/db小鼠研究。cryo-MOST成像顯示15W 模型組db/db和對照組db/m小鼠腎臟四個亞區(qū)可顯著區(qū)分（圖5A），腎積水表現(xiàn)在ISOM（圖5B），導(dǎo)致腎實質(zhì)、皮質(zhì)和ISOM體積增大。對腎單位形態(tài)分析（圖5D-K），腎小球形態(tài)和表面積顯著增大、腎小管直徑顯著增大。與UUO不同的是，慢性腎積水模型腎小管未出現(xiàn)中央凸起（圖5H-K），可能與兩種模型病因和嚴(yán)重程度不同有關(guān)。表明cryo-MOST不僅可以有效地顯示和分析db/db小鼠的自發(fā)性腎積水，還可以區(qū)分慢性和急性腎積水引起的不同類型的結(jié)構(gòu)損傷。

進一步重建并量化腎血管網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)葉間血管存在少量變形，僅部分葉間血管腎積水區(qū)附近靜脈橫切面呈扁圓型（圖6A、B）；功能性毛細(xì)血管密度無差異。

圖6 15W db/m和db/db小鼠腎臟腎血管的3D重建和量化

最后，探討了 db/db 小鼠腎積水的原因。亞甲基藍注射和壓力測試，排除輸尿管梗阻和尿道未阻塞后，但發(fā)現(xiàn)輸尿管雙側(cè)壓力顯著降低（圖7C-D），存在雙側(cè)膀胱輸尿管反流。成像顯示亞甲基藍已回流到腎髓質(zhì)（圖7E）。利用排尿點分析 (VSA)實驗驗證膀胱異常（圖7F-I），分析尿斑頻率分布表明膀胱過度活動。因此db/db小鼠腎積水的形成和發(fā)展可能與膀胱輸尿管反流和膀胱過度活躍有關(guān)。

圖7 15W db/db小鼠的膀胱輸尿管反流和膀胱過度活動

在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)IVCF可以很好地保護腎臟的原位形態(tài)，而cryo-MOST在無標(biāo)記的情況下利用自發(fā)熒光成像可以用于獲得整個腎臟的三維圖像，包括其體內(nèi)灌注狀態(tài)和微米分辨率。通過對UUO、db/db和對照小鼠腎臟進行冷凍MOST成像，我們不僅觀察到積水腎的分布，還分析了多個腎臟結(jié)構(gòu)的變化，包括腎亞區(qū)、動脈、靜脈、腎小球、腎小管和功能性毛細(xì)血管。這些對積水腎及其對腎臟各種結(jié)構(gòu)的影響的綜合研究為理解病理學(xué)和預(yù)防疾病引起的損傷提供了科學(xué)依據(jù)。

全文鏈接：https://www.thno.org/v13p4885.htm

Fan G, Jiang C, Huang Z, Tian M, et al. 3D autofluorescence imaging of hydronephrosis and renal anatomical structure using cryo-micro-optical sectioning tomography. Theranostics 2023; 13(14):4885-4904. 

Deng L, Chen J, Li Y, et al. Cryo-fluorescence micro-optical sectioning tomography for volumetric imaging of various whole organs with subcellular resolution. iScience. 2022;25(8):104805.