駱清銘院士和龔輝教授帶領(lǐng)MOST團(tuán)隊(duì)發(fā)明的顯微光學(xué)切片斷層成像系列技術(shù)（MOST/fMOST）作為介觀尺度最精細(xì)的三維成像技術(shù)，伴隨著各種標(biāo)記技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已在神經(jīng)機(jī)制研究、腦疾病研究、心血管疾病研究以及病理毒理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

組胺是哺乳動(dòng)物大腦中的一種保守的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)節(jié)多種生理功能和病理過程。組胺能神經(jīng)元是腦中組胺唯一的來源，僅位于下丘腦后側(cè)的結(jié)節(jié)乳頭核(TMN)，其軸突幾乎可以投射到所有主要腦區(qū)。組胺很少通過突觸傳遞，主要通過組胺能神經(jīng)元軸突上的囊泡釋放，并迅速與周圍的組胺受體結(jié)合。因此，建立一個(gè)全面的組胺能神經(jīng)元輸出圖譜，看清所有軸突纖維投射分布特征，將是組胺能神經(jīng)元功能研究的一個(gè)重要里程碑。

以往的研究使用免疫組化技術(shù)探索了組胺能神經(jīng)纖維在大鼠腦中的分布，但受到標(biāo)記工具和成像技術(shù)的限制，這些研究還沒有在三維水平上展示全腦組胺能神經(jīng)元及其軸突纖維的分布。

2023年3月28日，浙江大學(xué)/浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳忠教授研究組與華中科技大學(xué)MOST團(tuán)隊(duì)合作，在國際知名期刊PNAS發(fā)表了題為Whole-Brain Mapping of Histaminergic Projections in Mouse Brain 的研究論文。在本研究中，研究者利用組氨酸脫羧酶(HDC)-CreERT2小鼠和遺傳標(biāo)記策略，用熒光顯微光學(xué)切片斷層成像技術(shù)（fMOST）在0.32μm × 0.32μm × 2 μm像素分辨率下重建了首個(gè)組胺能神經(jīng)元的全腦投射圖譜，并量化了所有腦區(qū)組胺能神經(jīng)纖維密度。通過稀疏標(biāo)記，重建了60個(gè)單組胺能神經(jīng)元的精細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)，揭示了個(gè)體組胺能神經(jīng)元的高度異質(zhì)性投射模式，為組胺能神經(jīng)元功能探索提供了研究基礎(chǔ)。

01  組胺能神經(jīng)元的全腦可視化和定量研究

為了特異性標(biāo)記整個(gè)鼠腦中對(duì)組胺能神經(jīng)元，作者構(gòu)建了HDC- CreERT2:Ai47小鼠，組胺能神經(jīng)元將表達(dá)GFP蛋白。對(duì)全腦進(jìn)行fMOST成像，并使用NeuroGPS系統(tǒng)以1μm x 1μm x 2μm像素分辨率測(cè)定下丘腦后側(cè)切片中GFP陽性細(xì)胞的數(shù)量，然后通過手動(dòng)校正精確地計(jì)算陽性細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示成年雄性小鼠大腦中有5000余個(gè)組胺能神經(jīng)元，每個(gè)半球的標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量約為2500個(gè)，反映了組胺能神經(jīng)元分布的對(duì)稱性。同時(shí)證實(shí)了該轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠很好的標(biāo)記組胺能神經(jīng)元，可以用于神經(jīng)投射圖譜的繪制。

圖1. 全腦組胺能神經(jīng)元空間分布及定量分析

02 組胺能神經(jīng)元軸突全腦投射圖譜

由于Ai47小鼠中GFP主要表達(dá)在胞體中，要繪制全腦組胺能神經(jīng)投射圖譜，需要找到一種方法來清楚地標(biāo)記組胺能神經(jīng)元胞體和軸突。為此，作者選擇了一種Cre依賴的AAV病毒載體，能夠在組胺能神經(jīng)元的胞體和軸突中表達(dá)明亮的GFP熒光蛋白，并且?guī)缀踉诿總€(gè)腦區(qū)都能觀察到信號(hào)。隨后通過fMOST進(jìn)行全腦三維成像，以0.32μm × 0.32 μm×2 μm像素分辨率重建了首個(gè)標(biāo)準(zhǔn)量化的小鼠全腦組胺能神經(jīng)投射圖譜。由于組胺能神經(jīng)元幾乎將軸突纖維投射到所有腦區(qū)，因此很難描述它們的分布特征。為了解決這一難題，作者計(jì)算了所有腦區(qū)中組胺能神經(jīng)元軸突纖維的密度，并根據(jù)熒光密度將它們分為密集、中等、稀疏三類。

圖2. 構(gòu)建全腦組胺能神經(jīng)投射圖譜

03 組胺釋放與組胺能神經(jīng)纖維密度相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究組胺能神經(jīng)纖維密度的生物學(xué)意義，作者在上述三組中分別選取了一個(gè)腦區(qū)進(jìn)行功能關(guān)聯(lián)性研究：密集組：內(nèi)側(cè)隔核（MS）、中等組：中央杏仁核（CeA）、稀疏組：海馬CA3，并選取200μm x 200μm x 200μm的區(qū)域三維展示其纖維分布特征。然后，作者使用光遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行了功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)組胺能神經(jīng)纖維的密度與釋放組胺量存在關(guān)聯(lián)性。

圖3. 不同熒光密度區(qū)域組胺能神經(jīng)纖維細(xì)節(jié)展示

04 組胺能神經(jīng)元的稀疏標(biāo)記全腦三維重建

為研究單個(gè)組胺能神經(jīng)元的投射模式，作者用稀疏標(biāo)記結(jié)合fMOST技術(shù)追蹤和重建了60個(gè)組胺能神經(jīng)元。對(duì)其投射纖維進(jìn)行了分支特性分析與投射方向分析，發(fā)現(xiàn)不同的組胺能神經(jīng)元之間存在較大的投射差異。隨后通過聚類分析進(jìn)行系統(tǒng)性分類，結(jié)果顯示組胺能神經(jīng)元群體難以按照投射趨勢(shì)自動(dòng)被分類為不同的亞群，作者猜測(cè)這可能是不同組胺能神經(jīng)元的投射方式互相差異過大導(dǎo)致的，提示分群理解需要其他特殊的方式。

圖4. 60個(gè)組胺能神經(jīng)元投射模式

05 組胺能神經(jīng)元分支全腦投射模式

為了探索組胺能神經(jīng)元投射群體的潛在分群模式，作者選擇了MS和上丘(SC)腦區(qū)，它們都位于冠狀面中線，且分別位于TMN前側(cè)和后側(cè)，組胺在這兩個(gè)腦區(qū)中介導(dǎo)不同的功能。將帶有不同熒光的AAV-retro病毒載體注射到這兩個(gè)腦區(qū)，逆行示蹤上游組胺能神經(jīng)元，。進(jìn)一步，重構(gòu)60個(gè)單組胺能神經(jīng)元驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)投射到MS與SC的組胺能神經(jīng)元確實(shí)存在明顯的分群，但胞體的空間位置分布并未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。

圖5. MS和SC腦區(qū)60個(gè)單組胺能神經(jīng)元投射模式

原文鏈接：

www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2216231120