駱清銘院士和龔輝教授帶領(lǐng)MOST團(tuán)隊(duì)發(fā)明的顯微光學(xué)切片斷層成像系列技術(shù)（MOST/fMOST）作為介觀尺度最精細(xì)的三維成像技術(shù)，伴隨著各種標(biāo)記技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已在神經(jīng)機(jī)制研究、腦疾病研究、心血管疾病研究以及病理毒理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
作為最復(fù)雜的器官之一，大腦擁有億萬級(jí)數(shù)量的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等各種類型的細(xì)胞。這些細(xì)胞處在錯(cuò)綜繁雜的連接網(wǎng)絡(luò)中。介觀水平全器官三維成像技術(shù)幫助我們更好地研究細(xì)胞的生理和病理表型，然而常見的成像方法通常步驟繁瑣且通量較低。

今年2月3日，MOST團(tuán)隊(duì)在國際期刊communications biology上發(fā)表了題為Three-dimensional mapping in multi-samples with large-scale imaging and multiplexed post staining的文章。該研究建立了一套稱為Array-fMOST的高通量單細(xì)胞水平全器官三維成像系統(tǒng)，可以在15天內(nèi)完成32個(gè)小鼠腦同步成像（分辨率0.65μmx0.65μmx0.3μm）?；谶@套系統(tǒng)，作者對(duì)阿爾茨海默癥、自閉癥、自然衰老等多種模型進(jìn)行成像，并將該技術(shù)應(yīng)用于多樣本細(xì)胞定位、分子表型鑒定、細(xì)胞構(gòu)筑、神經(jīng)投射等研究。

Array-fMOST全流程包括多樣本包埋、高分辨雙色成像、數(shù)據(jù)配準(zhǔn)和分析。成像包含兩種模式：連續(xù)成像和間隔成像。連續(xù)成像獲取連續(xù)三維數(shù)據(jù)集，保證自動(dòng)配準(zhǔn)特性，適合于神經(jīng)環(huán)路示蹤和單神經(jīng)元形態(tài)分析；間隔成像不僅可以定位全腦細(xì)胞分布，還可以將完整切片收集起來，以用于后續(xù)蛋白表型鑒定、病理染色等實(shí)驗(yàn)。

相比于單個(gè)樣本逐一成像，Array-fMOST在樣本制備、成像掃描、組織切片和成像系統(tǒng)調(diào)整方面節(jié)省了大量時(shí)間。同時(shí)，由于這些樣本是同步成像的，圖像冗余度、強(qiáng)度校正參數(shù)等用于數(shù)據(jù)處理的關(guān)鍵參數(shù)可以重復(fù)用于所有樣本，因此也減少了數(shù)據(jù)處理時(shí)間。

圖1. Array-fMOST全流程示意圖

研究人員對(duì)Thy1-YFP H-line和Thy1-EGFP M-line小鼠腦進(jìn)行Array-fMOST成像，發(fā)現(xiàn)Thy1-YFP H-line小鼠具有更強(qiáng)的熒光信號(hào)，這表明Array-fMOST系統(tǒng)能很好的對(duì)比不同樣本在相同成像條件下的熒光強(qiáng)度差異。

圖2. 不同品系小鼠腦熒光信號(hào)差異性

隨后，作者結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)和熒光染料灌注血管標(biāo)記技術(shù)，探索AD模型小鼠皮層中生長激素抑制素表達(dá)陽性細(xì)胞（SOM+）的空間表達(dá)以及血管的形態(tài)特征。利用Array-fMOST系統(tǒng)直觀地看到不同類型樣本間的形態(tài)差異：顯然，相比于對(duì)照組，模型組的SOM+細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常，血管空間密度降低。

圖3. AD模型小鼠SOM+細(xì)胞形態(tài)變化和血管密度變化

通過Array-fMOST的間隔成像模式收集連續(xù)切片，可以方便的與免疫熒光等技術(shù)聯(lián)用，在單細(xì)胞分辨率下，從多個(gè)樣本中篩選病理差異性。研究者對(duì)14周齡自然衰老小鼠（相當(dāng)于人類45-50歲）和3周齡的對(duì)照組小鼠SOM+細(xì)胞和神經(jīng)微環(huán)境變化進(jìn)行定量分析。正如以往研究所示，衰老小鼠聽覺皮層的SOM+細(xì)胞數(shù)量減少，而機(jī)制仍不清楚。為探究細(xì)胞丟失的機(jī)制，作者收集連續(xù)切片并進(jìn)行免疫熒光染色，對(duì)比3周齡小鼠，14周齡小鼠聽覺皮層SOM表達(dá)下調(diào)，而GFAP、PDGFRβ表達(dá)上調(diào)，這揭示了自然衰老過程中細(xì)胞丟失的空間分布模式。

圖4. 自然衰老小鼠蛋白分子表型鑒定

利用RV逆行跨單極標(biāo)記技術(shù)結(jié)合Array-fMOST獲取AD小鼠、自閉癥小鼠和正常小鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)中GABA能神經(jīng)元輸入環(huán)路?？梢娂膊∧Ｐ椭?，部分腦區(qū)的輸入神經(jīng)元顯著減少。

圖5. AD小鼠和自閉癥小鼠mPFC神經(jīng)元逆行投射全腦精確定量分析

以上研究數(shù)據(jù)證明了該技術(shù)的便捷性、可擴(kuò)展性和廣泛的適用性。Array-fMOST系統(tǒng)最大的優(yōu)勢之處在于可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本成像，快速對(duì)比不同樣本間的差異，為研究疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展提供了新的研究手段。

參考文獻(xiàn)

Chen S, Liu G, Li A, et al. Three-dimensional mapping in multi-samples with large-scale imaging and multiplexed post staining. Commun Biol. 2023;6(1):148. Published 2023 Feb 3. doi:10.1038/s42003-023-04456-3